液氮保存對人主動(dòng)脈瓣組織細胞活力的影響

　　20世紀60年代初，Ross首次成功地將人同種主動(dòng)脈瓣原位移植于人體，經(jīng)過(guò)近40a臨床技術(shù)和瓣膜保存方法的不斷改進(jìn)，國內外有關(guān)活性同種異體主動(dòng)脈瓣的研究不斷發(fā)展，同種生物瓣的研究和應用取得了很大進(jìn)步。人同種帶瓣管道具有中心血流、抗鈣化及抗血栓形成且無(wú)需術(shù)后長(cháng)期抗凝治療等優(yōu)點(diǎn)，從而在臨床應用上顯示出其他瓣膜無(wú)可比擬的優(yōu)越性及應用前景。盡管臨床上瓣膜的應用歷史比較早，但國內外對于同種瓣膜的組織活性與冷凍保存時(shí)間的相關(guān)性研究尚少見(jiàn)報道。本研究目的在于通過(guò)對瓣膜組織活性的量化，探討適宜的瓣膜保存期限，為臨床應用同種異體瓣提供可靠的實(shí)驗依據。

　　1、材料和方法

　　1.1 材料

　　選用(18～35)歲健康成年男性腦死亡30min內取材的主動(dòng)脈瓣20個(gè)。供體心臟均在腦死亡后30min內無(wú)菌取出，剪開(kāi)心臟四腔，4℃生理鹽水沖洗3次，用3層無(wú)菌塑料袋盛入供心并逐層線(xiàn)扎，冰壺帶回，在無(wú)菌臺上修剪成帶瓣管道。實(shí)驗分為新鮮瓣膜對照組(Ⅰ組)和冷凍保存組(Ⅱ～Ⅹ組)。對照組取材后不入液氮內保存，瓣葉剪下后直接供實(shí)驗用。冷凍保存組依據在液氮((196℃)中保存時(shí)間分為Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ組，分別為冷凍保存1，3，6，9，12，15，18，21，24mo的瓣膜。每組2個(gè)瓣膜共6個(gè)瓣葉。

　　1.2 方法

　　修剪備用的帶瓣主動(dòng)脈管道浸入含低濃度抗生素和二甲基亞砜(DMSO)的RPMI1640營(yíng)養液中，3層無(wú)菌耐低溫塑料袋分別束扎，外裹錫箔袋，標記時(shí)間后，置入4℃冰箱中2h，再置入液氮蒸氣中使瓣膜緩慢降溫，最后放入液氮中長(cháng)期保存，降溫速率保持在1℃?min-1 左右。定期添加液氮，使瓣膜始終保持在-196℃。實(shí)驗當日取保存不同時(shí)間的帶瓣管道在37℃水浴箱中快速復溫5min，然后掀去包裹薄膜，再在37℃無(wú)菌生理鹽水中快速復溫，復溫中不斷輕柔翻動(dòng)帶瓣管道，使其各部位的溫度均勻上升。新鮮組瓣膜及冷凍復溫后各組瓣膜均在超凈工作臺上無(wú)菌取出，剪切瓣葉并觀(guān)察其大體形態(tài)，分切瓣葉并切成1mm×1mm×1mm組織碎塊做以下實(shí)驗分析。

　　1.2.1 瓣膜細胞活力測定

　　組織碎塊置入2。5g?L-1 胰蛋白酶溶液在室溫下消化2～3h，200目鋼網(wǎng)過(guò)濾，濾液經(jīng)1500r?min-1 離心10min，去上清液，加入少量營(yíng)養液終止消化，1500r?min -1 離心10min，去上清液，制備成5×106左右的細胞懸液，加入20g?L-1 胎盼藍，滴入血細胞計數器，光鏡下計數四個(gè)大格內的著(zhù)色細胞和拒染細胞即活細胞，根據下式計算細胞活力：細胞活力=[拒染細胞數/(著(zhù)色細胞數+拒染細胞數)]×100%

　　1.2.2 組織培養觀(guān)察

　　各組瓣膜組織碎塊置入25mL培養瓶?jì)?，待組織塊貼壁后，加入少量含100mL?L-1 胎牛血清(FCS)的RPMI1640營(yíng)養液中，在37℃含50mL?L-1 二氧化碳培養箱中孵育72h，觀(guān)察組織生長(cháng)情況并追加少量營(yíng)養液。以后每3d更換營(yíng)養液一次，培養后3，7，10，14，17，21，24和28d在倒置光相差顯微鏡下觀(guān)察并攝像記錄。

　　統計學(xué)處理：瓣膜細胞活力測定結果以(x ±s%)表示，用SigmaStat2。0統計軟件包處理，冷凍保存組各組與新鮮瓣膜組組間數據行t檢驗，P<0。05為有顯著(zhù)性差異。

　　2、結果

　　2.1 瓣膜細胞活力

　?、窠M瓣膜細胞活力最大，為93.85%。Ⅱ～Ⅹ組細胞活力均較Ⅰ組減低(P<0.05)，且隨保存時(shí)間加長(cháng)而逐漸減低;Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ各組的細胞活力與Ⅰ組及Ⅱ～Ⅶ組相比明顯減低(P<0.05，Tab1)。表1 新鮮瓣膜組與冷凍保存瓣膜組的細胞活力對比(略)。

　　2.2 組織培養

　?、窠M組織培養1wk時(shí)細胞從組織塊邊緣開(kāi)始移行，細胞增殖較快，細胞數目較多，4wk時(shí)鏡下細胞占滿(mǎn)培養瓶壁;Ⅱ～Ⅶ組瓣膜組織細胞移行較新鮮瓣膜組稍晚，約1～2wk時(shí)間，細胞增 殖稍慢，細胞數目仍較多，4wk時(shí)鏡下細胞數較多;Ⅷ～Ⅹ組瓣膜組織細胞在2wk后開(kāi)始移行，細胞增殖較慢，細胞數目較少，4wk時(shí)鏡下細胞數較Ⅰ組明顯減少(Fig1～6)。

　　3、討論

　　人同種主動(dòng)脈瓣具有中心血流、抗鈣化及抗血栓形成且無(wú)需術(shù)后長(cháng)期抗凝治療等優(yōu)點(diǎn)，從而在臨床應用上顯示出其他瓣膜無(wú)可比擬的優(yōu)越性及應用前景。

　　臨床資料表明，人活性同種主動(dòng)脈瓣的耐久性(dura-bility)優(yōu)于無(wú)活性瓣膜。1962年，Ross首先在臨床上將人同種主動(dòng)脈瓣(human aortic valve homo-graft，HAVH)原位置換成功。同年Barratt-Boyes 報道了44例HAVH置換的成功經(jīng)驗，但這些瓣膜活性喪失，瓣膜10a衰壞率較高。

　　1960年代后期，臨床采用4℃營(yíng)養液保存的HAVH，其組織細胞在保存液中可存活1wk，瓣膜壽命延長(cháng)，衰壞率降低。1970年代后期，O’Brien等采用液氮保存的HAVH(cry-opreserved aortic valve homograft，CAVH)，行主動(dòng)脈置換術(shù)192例，發(fā)現瓣膜耐久性明顯提高，10a衰壞率為零;同時(shí)發(fā)現CAVH植入宿主體內9a3mo，經(jīng)細胞培養證明供體瓣纖維細胞能在宿主體內長(cháng)期存活，并提出纖維細胞存活的同種活細胞瓣膜(viable aortic valve homograft，VAVH)的概念。VAVH具有良好的血流動(dòng)力學(xué)、較強的抗感染、抗血栓作用且無(wú)需抗凝治療，它的抗張強度較無(wú)活性瓣膜大為提高，所有上述功能的優(yōu)越性都基于瓣膜組織良好的結構完整性，包括纖維細胞功能代謝正常及纖維支架的形態(tài)結構較完整等。HAVH的采集、滅菌處理、保存方法等均可影響瓣膜活性和組織代謝。采集時(shí)主要考慮二種因素的影響：供體的年齡和熱缺血時(shí)間(warm ischemia time，WIT)。供體選擇健康成年人，年齡多在20～35歲。

　　有資料表明，超過(guò)45歲的供體臨床使用后易發(fā)生瓣膜蛻變、鈣化和關(guān)閉不全。供體在心腔冷灌前主要為熱缺血損傷，隨WIT延長(cháng)，組織細胞可發(fā)生胞質(zhì)水腫、內質(zhì)網(wǎng)擴張、線(xiàn)粒體腫脹等可逆性損傷，隨WIT不斷增加，細胞可產(chǎn)生線(xiàn)粒體絮狀沉積、核膜溶解、核染色質(zhì)丟失、細胞裂解等不可逆性損傷，最終導致細胞死亡，因此應盡量縮短WIT。本研究中WIT控制在30min內，及時(shí)對供體心腔用4℃生理鹽水冷灌沖洗，盡快清除殘留在心腔及瓣膜上的血塊，有效地降低了瓣膜組織溫度，使瓣膜組織細胞代謝減慢，從而減低組織細胞因缺血缺氧產(chǎn)生的損傷。HAVH采集后應及時(shí)進(jìn)行滅菌處理。瓣膜應用早期，滅菌時(shí)使用毒性較大的化學(xué)物質(zhì)或以高能電子射線(xiàn)照射，組織抗張強度差，瓣膜耐久性差，已不再使用。目前瓣膜滅菌普遍采用低濃度抗生素滅菌法，這種方法能較好地保存組織活細胞。我們采用的HAVH處理和滅菌方法源于美國鹽湖城的L.D.S醫院，并把保存液中的小牛血清含量提高5%，經(jīng)此方法處理和冷凍保存的瓣膜臨床應用效果良好。瓣膜在降溫過(guò)程中加用適宜濃度的冷凍保護劑(甘油、DMSO等)，可有效地減少冷凍損傷。冷凍降、復溫對瓣膜組織結構，特別是內皮細胞影響較大。采用快速降溫(10～100℃?min-1 )時(shí)，細胞質(zhì)、細胞核和染色體內均有冰晶形成，細胞膜結構易于破裂;溫度驟降使細胞內酶變性導致低溫休克(thermal shock)對細胞的損害作用更甚于冰凍的機械作用。本實(shí)驗證明，緩慢降溫對組織的破壞較輕，而采用1℃?min-1 降溫效果最佳，這與有些報道結果相同。在不同的降溫速率，DMSO對組織細胞的 影響也不同，1℃?min-1 降溫時(shí)DMSO的適宜濃度為100g?L-1 。復溫常采用37～42℃水溶液中快速復溫，以減少組織過(guò)冰點(diǎn)時(shí)細胞再結晶的形成。

　　我們在快速復溫過(guò)程中，采用37℃恒溫水浴箱復溫，水溫始終保持于37℃左右，并快速解除包裹塑料膜，再在無(wú)菌溶液中梯度融解，冷凍保護劑得到及時(shí)稀釋?zhuān)瑥亩S持了組織細胞內外滲透壓的平衡，組織破壞較輕，并在順梯度濃度稀釋時(shí)加用適量營(yíng)養液，從而最大可能地保留了瓣膜組織活細胞。瓣膜組織觀(guān)察的指標有組織結構、組織活性、細胞增殖能力、代謝功能、細胞特異性抗原鑒定等，其中組織活性和細胞增殖能力是反映瓣膜是否具有活性的兩個(gè)重要指標?；钚允侵讣毎蚪M織維持自身和與外界能進(jìn)行正常交換的能力，組織活性主要觀(guān)測細胞活力，包括內皮細胞和纖維細胞的活力;細胞增殖能力則主要觀(guān)察組織細胞培養后的生長(cháng)情況。細胞活力測定可定量反映瓣膜組織細胞存活程度。從實(shí)驗結果可以看出，新鮮瓣膜的細胞活力最高，且細胞增殖能力較高，說(shuō)明新鮮瓣膜最大限度地保留了組織活細胞，組織結構較完整，細胞增殖活躍。液氮保存的瓣膜組織細胞活力均較新鮮瓣膜顯

　　著(zhù)減低，說(shuō)明液氮保存1mo的瓣膜組織細胞即出現損傷情況，且其程度與瓣膜冷凍保存時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系，冷凍保存時(shí)間愈長(cháng)，瓣膜組織細胞損傷愈重，組織細胞存活率愈低。理論上認為，液氮保存時(shí)組織代謝接近停止，瓣膜活細胞可長(cháng)期保存，但瓣膜組織代謝雖處于低水平，卻沒(méi)有完全停止，細胞仍處于緩慢的無(wú)氧代謝過(guò)程，細胞內外可能仍有離子交換及滲透壓的改變，隨保存時(shí)間延長(cháng)，細胞內外代謝產(chǎn)物不斷積累，以及冷凍降溫過(guò)程中各種物質(zhì)濃度積累到有害程度，可導致細胞完整性的破壞，從而使細胞受到損傷。液氮保存1～15mo瓣膜組織活細胞在60%以上，組織培養后的細胞生長(cháng)情況較好，證明液氮保存1～15mo的瓣膜組織保留大部分的組織活細胞，且細胞增殖能力仍在較高水平，瓣膜組織活性較高。而液氮保存18～24mo瓣膜組織活細胞在50%或以下，且細胞增殖能力較差，雖然保留了部分組織活細胞，但從整體上看，瓣膜組織活性較低，因此臨床應用價(jià)值較小。

　　綜上所述，液氮保存可影響瓣膜的組織代謝和活性，其程度隨保存時(shí)間延長(cháng)而逐漸加重。結合形態(tài)學(xué)及相關(guān)資料可以認為，液氮保存1～15mo瓣膜組織活性仍較高，瓣膜組織代謝相對處于較高水平，臨床應用價(jià)值較大;而液氮保存18～24mo瓣膜組織活性明顯減低，瓣膜組織代謝相對處于較低水平，瓣膜活性較差，其臨床耐久性可能減小。因此可認為，人同種主動(dòng)脈瓣膜保存期限以15mo以?xún)葹橐恕?/p>